Долгая и извилистая дорога: дальше

Jan 26, 2024

Доступность технологии записи ДНК растет благодаря коммерциализации этих методов через различные услуги, от настольных принтеров ДНК до индивидуального синтеза.

Фото: CIPhotos/Stock/Getty Images Plus

Состояние синтеза ДНК немного похоже на путешествие человечества на Луну — то, что что-то было достигнуто раньше, не означает, что мы должны прекратить думать, как сделать это лучше».

Именно так Гарольд П. де Владар, генеральный директор и основатель поставщика услуг по производству длинных синтетических ДНК Ribbon Biolabs, видит огромные возможности в области синтеза ДНК. де Владар говорит, что синтез ДНК, эквивалентный высадке на Луну Аполлона-11, был знаковой работой Крейга Вентера по сборке бактериофага ΦX174 длиной 5386 п.о. из коротких одиночных нитей синтетической, коммерчески доступной ДНК, известной как олигонуклеотиды.1 Вентер и его команда из Института Дж. Крейга Институт Вентера построил геном ΦX174 с использованием адаптации полимеразной цепной реакции (ПЦР), называемой сборкой полимеразного цикла2, в 2002–2003 годах — сразу после секвенирования генома человека в начале 2000-х годов.

Эта проблема существовала еще несколько лет назад. «Когда я еще был исследователем, я столкнулся с проблемой создания длинной ДНК, желая синтезировать библиотеку небольших фаговых геномов длиной около 4000 пар оснований, и это был невозможный проект. Я хотел около 250 эпизодов, но это было недостижимо», — сказал де Владар.

Около 10 лет назад де Владар увидел, что в новостях начала появляться компания под названием Twist Bioscience. Он пришел к выводу, что люди все еще заинтересованы в синтезе длинной ДНК. «На первый взгляд вопрос синтеза ДНК казался решенным, но когда вы начинаете вникать в детали, как снизилась стоимость одного основания при секвенировании и так далее, вы понимаете, что эта проблема далека от решения» (Вставка 1).

Стоимость секвенирования резко упала за последние 10–15 лет темпами, опережающими закон Мура. Стоимость последовательности генома человека снизилась с примерно 1 миллиона долларов в 2007 году до 1000 долларов в 2014 году, а сегодня она приближается к 100 долларам, при этом серия Illumina NovaSeq X и Ultima Genomics UG100 заявляют о стоимости 200 и 100 долларов за геном соответственно. Но доступность индивидуального синтеза ДНК отстает, а стоимость остается относительно высокой. В течение последних нескольких лет наблюдалась общая тенденция к снижению затрат на синтез генов до 0,01 доллара за п.о., в отличие от менее 1–2 долларов за гигабазу, предлагаемых новейшими инструментами секвенирования следующего поколения.7

В 2018 году де Владар запустил Ribbon Biolabs в Вене, Австрия. Компания по синтезу ДНК может надежно создавать за день фрагменты размером 1 т.п.н., которые можно собрать в более крупные молекулы размером 10–20 т.п.н. Для этого Ribbon алгоритмически обрабатывает последовательность на более мелкие части, которые сортируются в дереве решений, чтобы определить лучшую комбинацию 10- и 12-мерных олигонуклеотидов (из их биобанка, насчитывающего около 80 000 олигонуклеотидов) для автоматической сборки. Реальное время выполнения заказа, включая проверку и доставку на основе секвенирования, для небольшой компании (со штатом всего несколько десятков сотрудников) составляет ~3 дня. Цель де Владара и Ribbon Biolabs — масштабировать синтез генов с помощью библиотечного подхода до 1000 КБ в день.

За счет совершенствования ферментов и стандартов сборки улучшились точность и количество молекул ДНК, которые можно объединить за один этап. За последнее десятилетие было разработано множество новых мощных методов сборки ДНК, включая сборку Gibson3. Эти методы сборки были применены при создании минимального бактериального генома4 и синтетических дрожжевых хромосом.5

Сборочные подходы к синтезу ДНК имеют ряд недостатков: они могут быть скомпрометированы примесями синтетических олигонуклеотидов, зависимостью метода от подтверждения последовательности из отдельного клона и необходимостью использования высокоточных корректирующих ПЦР-ферментов, которые необходимо использовать для копирования сконструированных гены для предотвращения мутаций во время амплификации.

Многоуровневый подход Ribbon Biolabs ограничен физическим размером синтезируемых молекул. «ДНК размером 20–40 т.п.н. — это действительно сложная молекула», — сказал де Владар. «Реакции уже не такие эффективные. Но это еще не самая худшая проблема: более длинные молекулы ДНК ломаются под действием чистой силы. Сама сборка не является проблемой; это манипуляция молекулами ДНК. Эту проблему мы тоже пытаемся решить, и у нас есть некоторые идеи в области исследований и разработок. Но он не сможет просто напечатать 30 КБ одним нажатием кнопки».